茶树多酚氧化酶研究进展
摘要：多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,PPO)是茶树(camellia sinensis)中普遍存在的一种酶，是红茶制作中品质形成的关键酶类。多酚氧化酶可催化氧化儿茶素类物质形成茶黄素类(TFs)色素，而后者对红茶色、香、味等品质形成具有关键作用。
关键词：红茶；茶黄素；多酚氧化酶
多酚氧化酶是一类末端氧化酶，酶分子由主酶和金属辅基组成。多酚氧化酶在自然界中分布极广，广泛存在于植物体内，能够催化氧化多酚类物质生成醌，在茶树生理代谢及茶叶加工等过程中对产品品质形成有极为重要的作用，也是植物叶子、果实等褐变的主要作用酶类。茶树多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)的研究始于19世纪末20世纪初。茶树PPO分子量大小为144000±16000，最佳底物为邻苯二酚，适宜的pH范围为5～7，最适pH值为5.7(以邻苯二酚为底物)嘲。多酚氧化酶以其在红茶加工中的重要作用受到广泛关注和研究。本文就多酚氧化酶的分类、蛋白质结构、基因结构、功能等方面阐述多酚氧化酶的相关研究。
1 多酚氧化酶的分类
根据多酚氧化酶催化底物的不同，多酚氧化酶分为单酚氧化酶(酪氨酸酶，tyrosinase，EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶，catchol-oxidase，E C.1.10.3.1)和漆酶(laccase，EC.1.10.3.2)等。多酚氧化酶的共同特征是能够通过有氧氧化酚或多酚类物质生成其对应的醌同。酪氨酸酶可有氧催化单羟基酚生成二醌。儿茶酚氧化酶可有氧催化邻苯二酚生成二醌。漆酶有氧催化苯酚或对苯酚生成对苯醌。酪氨酸酶和漆酶主要存在于微生物中，儿茶酚氧化酶则主要分布在植物中。酪氨酸酶活性中心有2个Cu2+，与周围N原子和O原子形成3种不同的状态，催化氧化过程分两步：首先使单酚及其衍生物邻位羟基化，生成邻二酚及其衍生物；二是氧化邻二酚及其衍生物生成相应的醌。漆酶的催化氧化作用主要表现在使底物生成自由基和酶分子中Cu2+的协同传递电子和价态变化。漆酶的催化底物范围很广，可以催化单酚、三酚、邻酚和对位二酚。此外，漆酶还可催化氧化维生素C、对苯二胺争屹。酪氨酸酶和漆酶工程菌已得到成功构建并表达。
儿茶酚氧化酶通常被称作多酚氧化酶(PPO)，普遍分布于植物体各器官和组织内。其含量和活性随植物体的生长而不断变化，分子量大小也因植物种类不同，同一种植物的部位不同、同一部位的多基因家族的控制成员不同而不同，且受植物生长条件的影响，具有空间和时间特异性。
按溶解状态茶叶PPO分为游离态和束缚态两大类。前者主要存在于细胞液中，为可溶态；后者较前者多而且主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，并与这些细胞器膜特异结合，为不溶态。
2 多酚氧化酶的细胞学定位
PPO是一种质体酶，存在于光合植物叶绿体类囊体以及非光合植物的质体类囊体中，如根细胞质体、表皮细胞质体、胚轴细胞质体、顶端组织细胞质体等。在光合组织部位中，PPO定位于叶绿体类囊体膜上；在非光合组织部位中，PPO定位于各种质体的囊泡中。但具有质体的组织细胞也可能不存在PPO，或者无PPO活性，例如在C4植物叶中，只在叶肉组织中探测到PPO活性，维管束鞘细胞尽管叶绿体丰富，却检测不到PPO活性。
3多酚氧化酶酶源及其同工酶
Tanaka T．等研究多种供试材料后发现这些材料匀浆液均可氧化EC和EGC形成茶黄素，其中枇杷、日本梨和蓝梅合成茶黄素的能力比茶叶强。吴红梅用不同材料和不同方法提取PPO并制取茶色素发现，茶、苹果、梨的PPO制取茶色素效果为佳。李适用毛栓菌PPO氧化儿茶素，产物中酯型茶黄素比例较高阎。赵淑娟进行微生物菌种筛选后得到一株产PPO菌株，对其进行发酵试验测得其酶活为256U/mL。
茶叶PPO同工酶的研究始于20世纪六七十年代。Buzun等通过聚丙烯酸胺凝胶电泳分离出了6种PPO组分，并测算出其分子量刚。安徽农学院从福鼎大白茶等材料中分离出PPO同工酶6～7条，它们均可促进邻苯二酚氧化，对表没食子儿茶素没食子酸酯、邻苯二酚氧化最为显著阎。刘仲华等从茶鲜叶中分离得到六条同工酶带，按照迁移率由小到大排列依次为PP01—PP06，其中PP02、PP04、PP06对多酚类敏感性较强，而PPO1、PP03、PPO5对多酚类敏感性不强。在催化儿茶素氧化聚合形成茶黄素(TFs)的过程中，各同工酶所起作用由大到小依次为：PPO1、PP03、PPO5、PP02、PP04、PP06。PPO1不仅热稳定性好，也成为最终唯一残留的PPO组分闭。葛超等研究发现不同品种梨的PPO同工酶的带数、迁移率和区带染色情况也存在差异。王坤波研究发现不同来源PPO同工酶的酶带相似，但酶带数目、Rf值及分子量均有差异：梨有11条同工酶带，苹果4条，茶叶5条，蘑菇5条，而漆酶只有1条。酶带Rf值集中在0.40—0.70；茶叶PPO同工酶的相对分子量大于94kDa。并分析比较得出不同来源PPO合成茶黄素能力由大到小为：梨PPO，茶叶PPO，微生物PPO，苹果PPO，漆酶PPO，蘑菇PPO。在所有供试梨品种中，丰水梨PPO同工酶谱带最多，酶活性最大，合成茶黄素的能力最强闭。
4多酚氧化酶的蛋白质结构
现有研究表明PPO定位于质体膜上。PPO首先在细胞质中合成含有转运肽（导肽）的前体肽，导肽引导PPO进入质体后被切除，PPO成为有活性的成熟蛋白。导肽通常位于N末端，含有80~90个氨基酸，蛋白酶切割的位点一般是丙氨酸一丝氨酸或丙氨酸一丙氨酸之间。导肽N端含大量的亲水性氨基酸残基，C端约有50%疏水氨基酸残基。在PPO的C端非编码区还含有一些糖类，可能对维持PPO的正确构象起作用。植物PPO具有高度的同源性，功能活性部位都有两个富含组氨酸(His)的铜离子结合区(CuA和CuB)，CuA区和CuB区各有3个保守的His，通过配位键形成特定的空间三维结构。Klabunde对成熟PPO进行晶体衍射研究印证了铜离子与组氨酸共价结合，其中H88.H109.H218与CuA共价结合，CuB与Hzlo.H244.H274共价结合。
5多酚氧化酶的基因结构
借助基因工程技术对PPO基因研究至今，番茄、蚕豆、烟草、甘蔗、杏、美洲商陆、葡萄、日本梨、桃等的PPO基因已被克隆。对已克隆的植物PPO基因分析发现PPO是由核基因编码表达，多基因控制的蛋白酶，具有基因家族的特性。大多PPO由多个基因编码，多则6～7个基因，少则2—3个。但对葡萄PPO基因研究发现，葡萄PPO是由单个基因编码表达。赵东以已发表的PPO基因中的保守序列设计引物克隆得到茶树PPO基因部分序列，发现茶树PPO基因与其它植物的PPO基因同源性较高，尤其是铜结合部位序列基本一致。
与其他真核基因不同，已克隆的番茄、蚕豆、烟草、甘蔗、杏、美洲商陆、葡萄、日本梨、桃等的PPO基因均不含内含子。陈忠正等以英红9号茶叶为材料，克隆得到PPO基因全长序列，发现茶树PPO基因也没有内含子。郝欣以福鼎大白等茶叶为材料，分别从基因组DNA和RNA人手，克隆得到PPO基因全长序列，两种产物的核酸序列一致，同样说明茶树PPO基因不含内含子网。但研究发现香蕉、菠萝等PPO基因中有小片段内含子。
6 多酚氧化酶的生理功能
6.1 多酚氧化酶与红茶品质的关系
PPO作为红茶发酵中的关键酶，对茶叶品质的形成至关重要，对茶叶适制性有很大的影响。茶叶中PPO含量高、活性大，有利于红茶品质形成与积累，适制红茶；反之则适制绿茶。红茶在发酵过程中利用茶叶自身酶系发生一系列化学反应，形成红茶特有的色、香、味。绿茶加工需要杀青，要高温使PPO迅速失活，失去酶促氧化功能以生产优质绿茶；而在红茶加工中则需要PPO充分发挥其酶促氧化功能，催化儿茶素类物质氧化形成茶色素类物质。儿茶素类底物氧化触发了一些香气前体物质的偶联氧化，生成各种各样的香气成分，从而形成红茶特有的品质。
竹尾忠一研究红茶制造中PPO的活性变化后发现鲜叶中PPO活性在茶叶萎凋过程中逐渐增加，酶活性随萎凋温度提高而有较快增长。不论轻萎凋或重萎凋，PPO活性均有快速增加。但另有研究表明PPO活性随茶鲜叶的失水而活性降低，适当补充水分后，PPO活性又得到恢复。刘仲华等研究发现，PPO活性随萎凋过程中茶叶失水而提高，含水量为65%左右时活性达到顶峰，但进一步过度萎凋使PPO活性降低。总之，萎凋过程中PPO活性的提高有重要的意义，是红茶制作工序中的关键步骤。
红茶发酵过程中添加外源PPO可提高发酵叶中的PPO活性，有利于红茶的发酵，提高茶黄素含量，改善红茶汤色，增加红茶香气。七十年代开始，国内外利用PPO加速茶叶发酵制作高品质速溶红茶并取得显著效果。马铃薯、无花果、葡萄甚至是某些种属的真菌中的PPO应用到红茶制造中也均有利于红茶茶黄素的积累，使红茶茶汤颜色加深，香气加高，品质得到相应提高。在黑茶和白茶加工中PPO均进行了不同程度的催化反应，有利于形成各自特有的品质特征。
应用茶鲜叶匀浆悬浮发酵工艺生产红茶，在发酵方式上较传统发酵工艺有所变化。夏涛研究茶鲜叶匀浆悬浮发酵后发现，悬浮发酵中PPO活性受到抑制，但仍能正常催化儿茶素类底物生成茶黄素类物质。悬浮发酵体系中添加有机溶剂可增加溶氧，明显促进PPO氧化儿茶素类底物生成茶黄素。
6.2 多酚氧化酶的其他功能
光合植物中PPO定位于叶绿体类囊体膜上，由此推测PPO可能与植物光合作用有关，PPO可能对光合作用进行反向调节并参与构成电子传递链和能量转换[44,45]。通过对金鱼草素合成酶的研究发现，金鱼草素合成酶以查耳酮为特异底物，催化生成橙酮，而后者是花色素形成的主要原因，金鱼草素合成酶与PPO的结构极为相似，由此推测PPO可能参与花色素的形成。此外有研究表明PPO还与植物体中乙烯的形成等生长发育过程有关。
PPO参与植物体的损伤免疫应答。植物组织受损伤时，PPO增加表达量，与酚类底物作用生成酮，酮与蛋白质共价结合降低了亲核氨基酸的营养供应能力，从而可抵御病虫危害，促进伤口的愈合。但PPO在病虫害等伤害中的作用机制尚未完全阐明，有待深入研究。此外，对真菌的PPO研究后发现，真菌PPO可以降解木质素，聚合木质素的氧化产物。
7展望
作为红茶制造中的关键酶类，PPO对红茶品质的形成有至关重要的作用。选择PPO含量高、活性高的茶叶资源生产红茶，有利于提高红茶的品质，拓展红茶市场。国内外尝试红茶制造中添加外源PPO对红茶发酵进行改善并取得了重要进展。速溶红茶制作时，添加PPO可提高红茶制取率，增加可溶性物质的含量，减轻红茶的苦涩味，显著提高了速溶红茶的品质。茶黄素作为红茶中的主要品质因子，在抑菌、抗病毒、降血糖、降血脂、降血压、抗氧化、抗突变、抗衰老、抗癌防癌等方面也卓有成效，已有抗龋齿牙膏等多种产品面市。但由于茶叶本身PPO含量不高，生产的红茶中茶黄素含量也相应较低，而且提取制备复杂，产品纯度低、成本高，难以规模化生产。如何以儿茶素类物质为原料，筛选活性高的PPO应用于红茶生产、茶黄素合成、速溶茶生产，具有重要的实际意义。
基因工程技术的发展和茶叶研究的深入使得二者能够结合起来。应用基因工程技术，克隆高活性的PPO基因，构建表达工程菌，获得工程蛋白酶，应用于红茶生产，有利于提高红茶品质，而且可广泛应用于红茶加工、茶黄素生产等方面，这也将推动我国红茶产业的发展。
应用基因工程技术可获得茶树优良种质资源。黄建安等采用PCR-SSCP分析与个体DNA测序相结合的方法研究茶树PPO基因，并对酶切位点变异作进一步的PCR-RFLP分析，探讨了SNP与茶树品种适制性及遗传背景的关联性，并指出HpaⅡ酶切位点在引物L7/L8扩增区段多态性较丰富，适制红茶的品种多为AA基因型，此位点能被HpaⅡ完全酶切。基因重组技术促进了PPO基因的克隆与体外表达。番茄、苹果的PPO基因在大肠杆菌中已得到表达，但表达产物不具有活性。李桂琴等对鸭梨PPO基因编码区序列进行了克隆及表达，表达产物具有酶活性，但活性较低。其原因可能有：一是由于大肠杆菌自身的保护机制，自身的蛋白酶将外源表达蛋白视为异物而将其降解，导致无目的蛋白积累；二是PPO活性的发挥需要铜离子结合并形成正确的三维结构，但由原核表达系统缺乏翻译后加工过程，表达的蛋白并未正确折叠，而是形成包含体，导致酶的活性比较低。此外，在原核表达系统DNA转录、翻译过程中稀有密码子缺少、碱基错配、突变等原因均有可能造成蛋白无表达或无活性。吴贻良用成熟PPO基因构建表达载体，经IPTG诱导表达后得到部分可溶性蛋白，但大部分为不可溶蛋白，将蛋白复性后，所得酶活为20.12U/mg;又把成熟PPO基因分别克隆人非分泌型载体pPICZA和分泌型载体pPICZaA，在毕赤酵母GS115表达后测其酶活分别为29.12U/mg和26.92U/mg阁。因此，如何获得高表达高活性的PPO基因，如何解决原核表达系统的包含体问题，以及如何提高PPO基因体外表达蛋白的活性是未来研究的核心问题。
相比较常规游离酶制剂，固定化酶技术有着显著的优越性：稳定性高、重复性好、经济实用等。国内外固定化PPO的方法主要有包埋法和吸附一交联法等。在优质红茶、茶黄素生产中，为了更有效地利用PPO，PPO固定化研究也将受到越来越多的关注。
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