茶多酚的离体抗氧化作用
（□SAYYES提供）
蒋建伟 何文珊 严玉霞 岑颖洲
摘 要 目的和方法：采用分光光度法及电泳法，以离体RBC膜，肝匀浆还原型谷胱甘肽(GSH)水平，质粒DNA损伤程度为检测指标测定茶多酚对离体生物组织的抗氧化作用。结果：茶多酚能显著抑制紫外线致人RBC溶血作用(P＜0.01)；能显著抑制60Co γ射线致质粒PUC19DNA单链断裂作用(P＜0.05或P＜0.01)；对VitC/Fe2+激发的肝匀浆GSH耗竭，茶多酚也具有显著的抑制作用(P＜0.05或P＜0.01)。结论：茶多酚具有良好的抗氧化作用，能保护离体RBC，组织GSH，DNA免受氧自由基损伤。
主题词 茶；溶血；质粒；谷胱甘肽
The antioxidative effect of tea polyphenols in vitro
JIANG Jian-Wei， HE Wen-Shan， YAN Yu-Xia， CEN Yin-Zhou1
Dept. of Biochemistry, Medical College, 1 Dept. of Chemistry,
JinanUniversity, Guangzhou (510632)
Abstract AIM:To assess the antioxidative effect of tea
polyphenols (TP) on free radical damage. MEHTODS: Used hemolysis,
changes of conformation of plasmid PUC19,
glutathione(GSH) levels of
mice liver homogenates as indexes. RESULTS: TP could reduce
significantly the degree of hemolysis of erythrocyte suspensions
induced by UV (P＜0.01). TP could reduce the degree of single-strain
break of plasmid PUC19 induced by 60Co γ-rays (P＜0.05 or P＜0.01).
TP could inhibit the exhaustion of GSH levels of mice liver
homogenate initiated by Vit C/Fe2+ (P＜0.05 or P＜0.01). CONCLUSION:
TP had a good antioxidative function, it can prevent RBC membrane,
plasmid DNA, tissue GSH suffering from oxygen free radical damage in
vitro.
MeSH Tea; Hemolysis; Plasmids;Glutathione
近年来研究发现茶叶除了有解渴提神的功效，还有消炎抑菌，降低血压、血糖，抗衰老，抗氧化，抗癌，抗突变等功效［1，2］。茶叶中的主要活性成分是嘌呤类生物碱及多酚类化合物。茶多酚(tea polyphenols, TP)是茶叶中分离提纯的多酚类化合物复合体，约占茶干物重的25％,它有30多种酚性物质组成,其中儿茶素类含量最多［1］。研究茶多酚清除生物自由基的作用与机理，对茶叶的药用研究有较大的理论和应用价值。目前对活性氧自由基清除作用的研究通常用电子自旋共振法(ESR)进行［3，4］，但实验仪器昂贵，操作也较复杂，一般实验室难以应用。本文采用分光光度法及电泳法研究茶多酚对离体RBC膜，DNA，肝组织匀浆的抗氧化作用，来探讨茶多酚的生物学活性。
材料与方法
一、材料：
茶多酚：广东英德茶厂生产，纯度＞95％。DTNB［5,5"－二硫双-(2-硝基苯甲酸)］，FLUKA公司出品。还原型谷胱甘肽(GSH)，上海酵母厂生产，生化试剂。PUC19购自华美公司。 昆明种小鼠，20～22 g，雄性，购自本校动物中心。新鲜健康人血，购自本院第一附属医院血库。
二、方法：
1.照射条件：紫外线(ultravoilet, UV)照射用30 W UV灯进行，样品分装于10 mL烧杯内，置于灯正下方10 cm处，照射25 min。质粒PUC19照射采用60Co γ射线照射，样品距源中心线60 cm，高120 cm，照射剂量率为16.67 Gy/min，照射剂量为100 Gy。
2.溶血试验：人血RBC用生理盐水(NS)洗涤后，作1:90稀释，分组见表1,每组重复6管。加样后用30W紫外灯照射25min，然后置4℃ 24 h，离心取上清，用722分光光度计于540 nm测吸光值(A)。
3.质粒PUC19 DNA断裂试验：取0.67 μg/μL粒2 μL，加入一定量的茶多酚，加入TE缓冲液（pH7.4），使终体积为32 μL，分组见表2。60Co γ射线100 Gy照射后，置4℃ 8h，用0.8％琼脂糖电泳（电泳缓冲液为0.5×TBE，电泳70V 3h），后用溴乙锭（EB）染色15 min。采用凝胶图像扫描系统扫描电泳结果，求出各孔超螺旋、开环型质粒所占的百分率。以λ DNA/HindⅢ Markers作为标准分子量对照物，以检测各条电泳带的DNA分子大小及构象。
4.肝匀浆GSH耗竭与测定：小鼠脱颈椎致死，立即取出肝组织，以4℃生理盐水作5％(W/V)组织匀浆，取2 mL肝匀浆，加入一定量的茶多酚(TP)及生理盐水(NS)，见表3，每组重复7管。加入1 mmol/L VitC和50 μmol/L FeSO4各0.2 mL，37℃水浴孵育60 min，激发氧自由基致GSH耗竭［5］。后用2 mL 10％TCA沉淀蛋白，离心取上清0.5 mL,加入0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH8.0)2 mL及0.04％DTNB显色剂0.3 mL，混匀5 min后用722型分光光度计412 nm处测吸光值(A)。
以1 mmol/L GSH用同法作标准曲线，将上述吸光值代入GSH标准曲线回归方程，求得组织GSH含量，单位以μmol/g湿重表示。
各项数据用平均数和标准差()表示，t检验判定两组间差异的显著性。
结果
(一)溶血试验：结果见表1。
表1 TP拮抗UV致人血RBC溶血作用
Tab 1 Effect of TP on hemolysis degree induced by UV
TP n Absorbance
()
0 6 0.550±0.037
1.67 mg.mL-1 6 0.019±0.007*
3.33 mg.mL-1 6 0.011±0.002*
*P＜0.01, vs 0 group
实验得出，UV可致人血RBC溶血，茶多酚显著抑制UV致血RBC溶血作用，与对照组相比，差异十分显著(P＜0.01)。
(二)质粒PUC19DNA单链断裂测定：质粒PUC19是双链环状DNA，2 686 bp。双链环状DNA常呈超螺旋构象，若DNA单链断裂则转变为开环型质粒，若双链断裂则转变为线型质粒。60Co γ射线照射可导致DNA链断裂。实验证明，低剂量(10～180 Gy)γ射线照射，导致部分DNA单链断裂，呈超螺旋和开环型质粒，未发现线型质粒；高剂量(例400 Gy)照射，则导致DNA双链断裂，全部转变为线型质粒。本实验采用100 Gy γ射线照射，部分超螺旋DNA由于单链断裂而转变为开环型，茶多酚抑制了受照开环型质粒百分率的升高，即抑制了受照质粒DNA单链断裂作用,与照射对照组相比,差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)，结果见表2、图1。
表2 60Co γ射线致质粒PUC19 DNA单链断裂的测定
Tab 2 Test of single-strain break of plasmid PUC19
induced by 60 Co γ-rays ()
Group n TP
(mg.mL-1) Supercoil
(%) Open coil
(％)
Control1 2 0 69.68±2.47 30.32±2.47
Control2 3 0 49.06±2.28 50.94±2.28
TP1 3 2.81 55.97±2.84* 44.03±2.84*
TP2 3 5.62 59.32±4.24* 40.68±4.24*
TP3 3 8.43 62.78±0.93** 37.12±0.93**
Control1：control and not irradiated; Control 2:control and irradiated
*P＜0.05, **P＜0.01, vs control 2
Fig 1 Test of single-strain break of plasmid PUC19 induced by 60 Co γ－rays
A： Supercoil；B：Open coil
1： λDNA/Hind Ⅲ Markers； 2， 3： Control and not irradiated； 4，5，6： Control and irradiated； 7，8，9： TP1； 10，11，12： TP2；13，14，15： TP3
图1 60Co γ射线致质粒PUC19 DNA单链断裂的测定
(三)肝匀浆还原型谷胱甘肽(GSH)耗竭与测定：对Vit C/Fe2+诱使的小鼠肝匀浆GSH耗竭， 茶多酚有显著的抑制作用(P＜0.05或P＜0.01)。结果见表3：
表3 TP拮抗 Vit C/Fe2+致使小鼠肝匀浆GSH耗竭的测定
Tab 3 Test of TP inbibition the exhaustion of GSH levels of mice
liver homogenate initiated by Vit C/Fe2+ (,n=7)
TP Absorbance(A) GSH(μmol.g-1)
0 0.164±0.025 7.96±0.23
0.45mg.mL-1 0.185±0.023* 9.12±0.12*
0.90mg.mL-1 0.229±0.030** 11.60±0.51**
*P＜0.05, **P＜0.01， vs 0 group
讨论
溶血试验是检测生物抗氧化试验的常用方法之一。UV照射RBC悬液，激发水产生.OH，.OH是目前已知的最强氧化剂［6］。.OH攻击RBC膜上多不饱和脂肪酸导致脂质过氧化，致使膜通透性增加，血红蛋白渗出导致溶血。茶多酚显著抑制了UV导致的RBC溶血作用，说明茶多酚能抑制RBC膜的.OH的氧化损伤。
用质粒DNA代替基因组DNA来作为抗自由基损伤的检测指标有以下优点：DNA损伤程度检测简单、迅速；细胞内有较强的DNA修复系统，而质粒中没有；细胞中有一系列抗氧化的酶(SOD，CAT，GSH-Px)，有一些代谢中间产物、氧化还原体系而质粒中没有。采用质粒做实验对象，避免了这些因素的干扰。质粒是双链环状DNA，呈超螺旋构象。在质粒提纯过程中，由于机械剪切作用可能出现开环、线型质粒。我们选用的质粒PUC19为超螺旋，开环两种。60Co γ射线导致质粒DNA辐射损伤主要是由于.OH作用引起的［7］。100 Gy照射质粒，其超螺旋型质粒百分率明显下降，开环型质粒百分率明显升高，说明自由基导致了DNA单链断裂。而茶多酚抑制了开环型质粒百分率的升高，(P＜0.05或P＜0.01)，说明茶多酚抑制了.OH致质粒DNA的辐射损伤作用。
肝组织GSH水平测定亦可用作检测抗氧化作用。GSH是谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）作用的必需底物，它可被氧化为氧化型谷胱甘肽。GSH可用DTNB显色法直接测定［8］。Vit C/Fe2+是氧自由基发生系统［5］，氧自由基氧化GSH导致GSH耗竭，茶多酚抑制了氧自由基对GSH的氧化作用，说明茶多酚具拮抗氧自由基损伤的作用。
茶多酚是一类多酚类化合物，它具有还原性。本实验证明，茶多酚对离体RBC，DNA或肝匀浆的氧自由基损伤具有显著的抑制作用。
* 广东省自然科学基金资助
作者单位：蒋建伟 严玉霞 暨南大学医学院生化教研室
岑颖洲 化学系（广州，510632）
何文珊 华南理工大学食品与生物工程学院
参考文献
1 陈为钧，万圣勤.茶多酚药效研究概况.中草药，1993,24(9):493.
2 于新蕊，曲军，丛月珠.茶叶的化学成分及药理作用研究进展.中草药，1995,26(4):219.
3 沈生荣，赵玉芳，杨贤强，等.茶多酚保护生物大分子的自由基机理.浙江农业大学学报，1995,21(4):361.
4 邹曦露，万谦，李美芬，等.茶多酚对鼠心肌缺血再灌产生氧自由基的清除.波谱学杂志，1995,12(3):237.
5 许实波，赵金华，胡群，等.软珊瑚胆甾烯抗氧化作用研究.中国药理学通报，1997,13(1):81.
6 李培峰，李文彬.自由基与抗衰老研究.见：方允中，郑荣梁，沈文梅，主编.自由基生命科学进展.第2集.第1版.北京：原子能出版社，1994.7～11.
7 周丽君，方允中，章扬培，等.质粒pBR322的γ辐射损伤效应.辐射研究与辐射工艺学报，1993,11(1):28.
8 朱大江，褚先秋，都定元，等.充血性心力衰竭肝组织还原型谷胱甘肽与丙二醛变化及超微结构观察.贵州医药，1996,2(3):136.
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