一个世纪以来氧化酶研究的进展(续)
（□SAYYES提供）
李荣林方辉遂
(浙江农业大学茶学系310029)
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Abstract
The investigation on polyphenol oxidase intea sphere has been startedsince the blackteafermentation.Yhe tea fermentation was historicalyconsidered as the action of microorganisms.Afterthen,it was gradually revealledthatthefermentation is the function of the internalenzymes in tea.Finally,it was confirmed thatthis process is mainly completed by polyphenoloxidase.Owing to its special position in tea processing,polyphenol oxidase .Owing to its opecial position in tea processing,polyphenol oxidase has been uninterruptedly studied in teasphere since the end of 18 century and theresearch ckntent has been greatly enlarged anddeepened.This paper tried to summarixe theresearch achievements on tea polyphenol oxidase in past one century
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四、80年代以来的进展
80年代以来对茶叶多酚氧化酶的研究依然兴趣不减，1980年前苏联学者Лруцлзе ГН在早期探索的基础上进一步提出萎凋时PPO分子形态可能发生了变化，PPO可以有高分子态和低分子态两种，萎凋时多酚酶可能发生低分子态向高分子态转化，使总酶活提高［３１，７
３］。1981年UllahMA提出萎凋时酶活因失水而下降，用适当的方法复水可使酶活得到一定程度恢复58，59］，1986年萧伟祥指出，近期的研究中关于萎凋时PPO活性变化趋势出现了两种完全相反的结论，他认为这是酶提取方法不同所致。丙酮粉法测出的是总酶活，而匀桨法测出的是可溶性的活性。萎凋时可溶性酶活性下降，而总酶活上升［53］。1988年刘仲华研究表明，用丙酮粉法提取酶浸提与不浸提相比酶活有很大不同，浸提12小时酶提取液活力几乎提高一倍［65,66］。实际上早先Roberts已经观察到类似结果［16］。1986年萧伟祥对红茶中残留酶作了详细研究，发现PPO在成品茶中仍有一定活性(31，32)。1981年DixMA用葡萄糖凝胶测定了POD和PPO的分子量，以蓝色糊精等进行校正，01NKCl柠檬酸洗脱，PPO在12Vc有一弱肩峰，分子量142000，另一峰在139Vc，分子量71000，证明PPO具有高分子态和低分子态两种状态。以后有人用高速离心法测定出PPO分子量，如以U(偏微分比容)07-078计算，PPO分子在128000-160000之间，即144000±160000［31］。80年代以来多酚氧化酶同工酶研究受到进一步重视。茶的多酚氧化酶同工酶研究始于60年代中期，1965-1966年竹尾用淀粉凝胶把PPO分成3个组分［45］，1966年Ｇｒｅｇｏｒｙ用Ｇ１５０也得到3条同工酶。1981年刘维华用聚丙烯酰胺凝胶电泳［62］，1983年安徽农学院茶叶系用圆盘电泳［31］分别从萎凋叶中获得了5条同工酶。1988年叶庆生研究发现萎凋中总酶活下降，而且所得6条同工酶活性也呈下降趋势(65)。1988年胡振长研究了杀青过程中多酚氧化酶同工酶的变化，发现杀青后仍存在1-2条同工酶［67］，1989年刘仲华研究了红茶制造过程中多酚氧化酶同工酶的动态，证实萎凋中有新的同工酶产生［65］。
1990年施兆鹏研究了黑茶制造过程中多酚氧化酶的变化，结果表明杀青后同工酶由6条减为2条，至渥堆开始时这两条同工酶也消失，渥堆12小时有新的同工酶出现，作者认为这是微生物分泌出多酚氧化酶的结果［69］。
1988年屠幼英测定了多酚氧化酶同工酶的等电点［70］，1991年又测定了各同工酶分子量74］。1990年谭振初［71］,刘仲华［69］各自独立地证明柠檬酸可促使多酚氧化酶活化。稍早一些时候Ｔｏｃｋｌａｉ试验站Ｃｈｏｕｇｈｕｒｒｙ Ｍ．提出果胶质和果胶酶能抑制PPO活性(51)。
1990年屠幼英、吴小崇证实萎凋时可溶性PPO活性下降，而PPO总酶活性上升，但这种变化与失水无关，萎凋中确有新的同工酶出现，已糖激酶能够促进萎凋叶多酚氧化酶活性的提高而抑制鲜叶多酚氧化酶的活性［72］。1991年屠幼英总结了PPO抑制剂的类型，有硼砂、酚类、亚硫酸钠、Vc、半胱胺酸、二乙基二硫代硫酸钠等［70］。80年代以来多酚氧化酶同工酶在茶树育种和生理上的应用取得显著进展。前苏联学者曾提出PPO活力和PPO酶蛋白含量可作为发酵力的指标［76］，我国学者龚景文、陈兴琰(1988)研究了若干茶树品种POD、PPO以及酯酶同工酶的差异，认为同工酶可作为品种分类的依据［77］。浙江农业大学茶学系(1988)建立了同工酶数据处理方法（76）。黄惠华(1991)研究了PPO的等电点，发现叶与花的同工酶等电点基本无异，可以视为遗传特征［76］。
1983年鸟屋尾忠之等人研究了PPO与茶树遗传的关系，认为PPO至少受两组基因的控制，作者估算了PPO广义遗传力和狭义遗传力的大小［79］。
1987年杨跃华研究了同工酶变化与茶抗逆的关系，认为逆境下茶树各酶系统包括PPO都有新的同工酶产生［79］，唐继平(1987)［81］，StephenSN/(1990)［88］研究了杂交后代PPO遗传的关系，指出PPO主要受优势亲本的左右。
1992年SinghHP研究了花器中多酚氧化酶的变异，结果表明整个花期中PPO在花器中的分布及同工酶特征都保持稳定，因此花器中PPO的特征可作为选种的依据［89］。
1993年王利琴用圆盘电泳分析了PPO同工酶与遗传的关系［82］。新近奚彪等提出用基因工程方法改变茶树体内PPO存在状态的设想［95］。
虽然已可以肯定红茶的变色过程中微生物不起主要作用，但微的可能作用仍不应忽视。
1973年富金原考由绿茶分离出两种产PPO菌株，枝孢霉(Ａｌｔｅｒｎａｒｌｌａ Ｔｅｎｎｉｓ)和链孢霉（Ｃｌａｄｏｓｐｏｓｉｕｍ Ｃ．）［８７］，苏联学者也分离到两株高产菌：Ｍａｃｅｉｌｉａｉｒ，Ｃｏｒｉｏｕｌｏｕｓ Ｈｉｒｓｕｔｕ［83，86］
。1987年加藤和冈本顺子研究了微生物PPO用于茶发酵的可行性［84］
。1992年印度学者从茶树叶片中分离出具有较高PPO的活性的7株真菌和3株细菌，并认为细菌更有前途［95］。1990年施兆鹏在研究黑茶渥堆中的PPO活性变化时也曾推测微生物在渥堆叶中分泌了多酚氧化酶［69］，所有这些研究为微生物在茶叶制造中的作用提供了新见解。
1983年李名君［86］，1985年Ｊｅｎｉｓｈ Ｃ［90］分别对茶叶中已知的酶系作了全面综述，1988年曾洪涛、刘仲华、李远志、张堂恒各自从不同角度讨论了茶叶加工中多酚氧化酶的应用问题［84，85，86］，刘乾刚对多酚氧化酶定位问题作了总结［94］。1992年Obenda从植物生理角度讨论了茶的多酚氧化酶ＣａｔｃｈｏｌＯｘｄｓｓｅ区别于Tｙｒｏｓｉｎａｄｅ(酪氨酸氧化酶)，Ｌａｃｃａｓｅ(漆酶)的独特性质［89］。1993年曾晓雄，1996年李荣林对茶叶加工中酶的利用现状和前景作了展望，侧重介绍了单宁酶和多酚氧化酶研究和利用中存在的问题［93，95］。
在茶叶加工中单宁酶的应用早已成功，并已应用了固定化酶，受此启发1981年ＰｒａｂｈａＴ．研究了芒果和茶叶多酚氧化酶的固定化［90］。1992年前苏联学者Ｃｈｉｎｄｉｌｉｓ Ａ．研究了多酚氧化酶酶电极的制作技术及酶电极法测定儿茶素的方法［91］。中国和日本学者也开展了相应研究［95］。一般认为茶的多酚氧化酶是一种邻二酚氧化酶，但已有证据表明茶叶的氧化酶提取物确有单酚氧化酶和三元酚氧化酶的活性，可以催化对香豆酸和焦酚的氧化。这表明茶多酚氧化酶是一个复杂的体系［95］。
一个世纪以来茶多酚氧化酶研究的进展是巨大的，但仍有众多的问题需要解决，特别是PPO的生理功能——末端氧化酶的真正地位问题至今仍缺乏明析的概念。与此相关的问题是多酚氧化酶的底物——茶多酚类物质的生理功能的研究仍相当贫乏。此外有关该酶的分子结构的研究
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